INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO GRO
LIC. BIOLOGÍA
BITACORA DE LA UNIDAD ii
MATERIA: BIOTECNOLOGÍA
Profesor: Francisco Javier Puche Acosta.
Alumna: elidene perez quintana
Viii semestre
Introducción:
Los tejidos vegetales es un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio artificia de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
El cultivo de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo
El cultivo de estos tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes.
Los orígenes del cultivo de tejidos se remontan al año 1902, cuando Haberlandt intentó cultivar células. La teoría de la toti potencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc.
Una cámara de cultivo es un receptáculo diseñado para permitir el control de algunas variables del ambiente físico. Habitualmente se pueden controlar la temperatura, la iluminación y el fotoperíodo y en algunos casos, menos frecuentes, la humedad del aire y su composición.
Existen muchos modelos de cámaras de cultivo, en unos casos se trata de espacios reducidos, frecuentemente móviles, mientras que en otros casos son verdaderos recintos acondicionados para permitir el control del ambiente interior.
Objetivos:
_Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo.
_Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales.
_Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.
_Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales.
_Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.
Metodología:
En esta unidad II abarcaremos con los siguientes temas como es tejidos vejetales es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo ya que el estudio de estos temas son de gran importancia tambien haremos practicas y r publicaremos en el blogger los temas vistos en clases.
Desarrollo:
2.1 Medios de cultivo
Es un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, células o incluso pequeñas plantas. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
2. 1. 1. Áreas del laboratorio de cultivo de tejidos:
La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo.
*Laboratorio
_Area de preparación de medios.
_Area de lavado y esterilización.
_ Cuarto estéril.
_Cámara de cultivo.
_Area de rusticación
*Material vegetal
_Plantas madres seleccionadas
(pre-acondicionamiento).
_ Explantes (elección, disección, esterilización, etc.).
*Condiciones de cultivo
_Asepsia.
_ Recipientes.
_Temperatura.
_Luz y fotoperíodo
2. 1. 2. Material y Equipo del laboratorio:
_Metales: Los más utilizados son el hierro y sus aleaciones, cobre, níquel, platino, plata y plomo. Con estos metales se fabrican soportes, pinzas, anillos, trípodes, triángulos, rejillas, sacacorchos, recipientes para agua, crisoles, espátulas, mecheros y electrodos, entre otros.
_Porcelana: Se fabrican cápsulas, crisoles, navecillas, espátulas, embudos, triángulos.
_Porcelana: Se fabrican cápsulas, crisoles, navecillas, espátulas, embudos, triángulos.
_Madera: Gradillas, soportes de pie para tubos y embudos.
_Corcho: Se usa principalmente en la elaboración de tapones.
_Caucho: Para fabricar mangueras y tapones.
_Asbesto: Se emplea en la fabricación de mallas, guantes y como aislante térmico.
_Asbesto: Se emplea en la fabricación de mallas, guantes y como aislante térmico.
_Teflón: Utilizado en la fabricación de mangueras, válvulas, llaves para buretas, recipientes, empaques entre otros.
_Vidrio: Es uno de los materiales más usados en el laboratorio. Aquél que se destina a la fabricación de equipo de laboratorio debe ser resistente a los ácidos y a los álcalis y responder a determinadas exigencias térmicas y mecánicas.
_Vidriería Común. Comprende los vasos de precipitados, los erlenmeyers, los balones de fondo plano y de fondo redondo, los embudos (al vacío, por gravedad, de decantación), tubos de ensayo, condensadores, frascos con tapón esmerilado, vidrios de reloj.
_Vidriería Volumétrica (de alta precisión). Este material suele ser más costoso debido al tiempo gastado en el proceso de calibración. Comprende una serie de recipientes destinados a medir con exactitud el volumen que “contienen” o el volumen que “vierten”.
Pipetas:
Las pipetas están diseñadas para trasvasar volúmenes conocidos de un recipiente a otro. Los tipos más comunes de pipetas son: las volumétricas (aforadas), las graduadas y las automáticas.
Buretas:
La bureta se utiliza para descargar con exactitud volúmenes conocidos (pero variables), principalmente en las titulaciones. Siempre se deben limpiar para asegurar que las soluciones se deslicen uniformemente por las paredes internas al descargarlas.
La balanza granataria:
Es uno de los instrumentos más utilizados en el laboratorio y su objetivo es determinar la masa de una sustancia o pesar una cierta cantidad de la misma.
El mechero:
El mechero es un instrumento de laboratorio de gran utilidad. Fué diseñado con el propósito de obtener una llama que proporcione máximo calor y no produzca depósitos de hollín al calentar los objetos.
El mechero es un instrumento de laboratorio de gran utilidad. Fué diseñado con el propósito de obtener una llama que proporcione máximo calor y no produzca depósitos de hollín al calentar los objetos.
2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo
Medios de cultivo: composición general
Compuestos inorgánicos
_Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42-
_Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I-
Carbohidratos
_Sacarosa, glucosa, mio-inositol
Vitaminas
_Tiamina (B1)
_Piridoxina
_Acido nicotínico (C)
_Biotina
Aminoácidos
_Glicina
Propiedades físicas de los medios de cultivo:
*Semisólido
*Liquido
_El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido).
_En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.).
-El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:
_Inducción de embriogénesis.
_Cultivo de protoplastos.
_ Cultivo de suspensiones celulares.
Grupos básicos de reguladores del crecimiento:
Auxinas: son un grupo de fitohormonas que funcionan como reguladoras del crecimiento vegetal. Esencialmente provocan la elongación de las células. Se sintetizan en las regiones meristemáticas del ápice de los tallosy se desplazan desde allí hacia otras zonas de la planta, principalmente hacia la base, estableciéndose así un gradiente de concentración.
La auxina ha sido implicada en la regulación de un número de procesos fisiológicos.
_Promueve el crecimiento y diferenciación celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta,
_Estimulan el crecimiento y maduración de frutas, floración, senectud, geotropismo,
_La auxina se dirige a la zona oscura de la planta, produciendo que las células de esa zona crezcan más que las correspondientes células que se encuentran en la zona clara de la planta. Esto produce una curvatura de la punta de la planta hacia la luz, movimiento que se conoce como fototrofismo.
_Retardan la caída de hojas, flores y frutos jóvenes dominancia apical
Citoquininas: Son hormonas vegetales naturales que estimulan la división celular en tejidos no meristemáticos. Inicialmente fueron llamadas quininas, sin embargo, debido al uso anterior del nombre para un grupo de compuestos de la fisiología animal, se adaptó el término citoquinina. Las citoquininas también se forman en las raíces y son translocadas a través del xilema hasta el brote. Sin embargo, cuando los compuestos se encuentran en las hojas son relativamente inmóviles.
Otros efectos generales de las citoquininas en plantas incluyen:
_Estimulación de la germinación de semillas
_Estimulación de la formación de frutas sin semillas
_Ruptura del letargo de semillas
_Inducción de la formación de brotes
_Mejora de la floración
_Alteración en el crecimiento de frutos
_Ruptura de la dominancia apical.
Giberelinas: El Acido giberélico GA3 fue la primera de esta clase de hormonas en ser descubierta. Las giberelinas son sintetizadas en los primordios apicales de las hojas, en puntas de las raíces y en semillas en desarrollo.
La hormonano muestra el mismo transporte fuertemente polarizado como el observado para la auxina, aunque en algunas especies existe un movimiento basipétalo en el tallo. Su principal función es incrementar la tasa de división celular (mitosis).
Además de ser encontradas en el floema, las giberelinas también han sido aisladas de exudados del xilema, lo que sugiere un movimiento más generalmente bidireccional de la molécula en la planta.
Además de ser encontradas en el floema, las giberelinas también han sido aisladas de exudados del xilema, lo que sugiere un movimiento más generalmente bidireccional de la molécula en la planta.
Acido abscísico:
El inhibe el crecimiento celular y la fotosíntesis. El ácido acido abscisico (ABA), conocido anteriormente como dormina o agscisina, es un inhibidor del crecimiento natural presente en plantas. Químicamente es un terpenoide que es estructuralmente muy similar a la porción terminal de los carotenoides:
Componentes de los medios de cultivo:
Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar :agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificante.
Generalidades:
- Actúan a bajas concentraciones
- Interactúan unos con otros (los resultadosestán determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas).
- Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todos su ciclo de vida pero su concentración fluctúa.
Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta.
- Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos.
generalidades de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo son soluciones acuosas donde se desarrollan los microorganismos. El desarrollo de los microorganismos solo ocurre en presencia de los nutrientes requeridos (que dependen del microorganismo particular).
medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, células o incluso pequeñas plantas. Según qué se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido.
Clasificación:
Según sus cualidades físicas distinguimos:
_Líquidos
_Semi-sólidos
_Sólidos
Los nutrientes son las sustancias necesarias para la síntesis de material celular y la obtención de energía. Estos nutrientes son orgánicos e inorgánicos (solo las organismos litotrofos pueden crecer en soluciones exentas de nutrientes orgánicos).
La diversidad del mundo microbiano hace que los medios de cultivo sean muy variados, tanto como determinen los requerimientos nutricionales de los microorganismos. Para el cultivo de bacterias heterótrofas todos los medios contienen como componentes principales: agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas.
Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original.
Algunos medios de cultivo incorporan sustancias con finalidades mas concretas, como los factores de crecimiento, colorantes, tampones, agentes solidificantes, etc.
Componentes de los medios de cultivo:
Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar :agua, sustancias orgánicas y sustancias inorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificante.
Agua: Suele utilizarse destilada. En ocasiones específicas puede utilizarse agua corriente, pero debe evitarse porque ciertos cationes (como Ca2+ o Mg2+) pueden formar sales insolubles con otros componentes del medio (como los fosfatos) sobre todo, durante la esterilización.
Sustancias orgánicas: Se pueden utilizar sustancias puras o mezclas de sustancias orgánicas Como sustancias puras más comunes se encuentran los azúcares: Frecuentemente son utilizados como fuente de carbono y energía por los microorganismos. Entre ellos, es común el empleo de monosacáridos como la glucosa, disacáridos como la lactosa y polisacáridos como el almidón. Ciertas bacterias no pueden utilizar los carbohidratos como nutrientes y se emplean otras sustancias puras (aminoácidos, ácidos grasos) o mezclas de sustancias orgánicas.
Cuando los requerimientos nutricionales de los microorganismos son complejos o se pretende un crecimiento rápido se utilizan mezclas de sustancias orgánicas. Las mezclas de sustancias orgánicas más comunes en la preparación de los medios de cultivo son las peptonas, el extracto de carne y el extracto de levadura.
Peptonas: mezclas de aminoácidos y péptidos. Resultan de la hidrólisis de proteínas o materiales proteicos (carne, vegetales, caseína, o gelatina).
Extracto de carne: concentrado de componentes hidrosolubles de la carne.
Extracto de levadura: Se obtiene por hidrólisis ácida o enzimática de levaduras
Las peptonas y los extractos de carne y de levadura se utilizan preferentemente como fuente de nitrógeno, fósforo y azufre orgánicos. Algunos de sus componentes se pueden utilizar como factores orgánicos de crecimiento o como fuente de carbono y energía.
2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock:
La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración. Durante cualquier trabajo experimental, el uso de soluciones se hace indispensable, por lo que es necesario conocer los procedimientos para su elaboración.
Una solución es una mezcla homogénea cuyas partículas son menores a 10 ángstrom. Estas soluciones esta conformadas por soluto y por solvente. El soluto es el que esta en menor proporción y por el contrario el solvente esta en mayor proporción. Tosas las soluciones son ejemplos de mezclas homogéneas.
_Solución diluida es cuando la cantidad de soluto es muy pequeña.
_Solución concentrada es cuando la cantidad de soluto es muy grande.
_ Solución saturada es cuando se aumento mas soluto en un solvente a mayor temperatura de la normal (esto es porque cuando ya no se puede diluir, se calienta el solvente y se separan sus partículas para aceptar mas soluto)
_Solución sobresaturada es cuando tiene más soluto que disolvente.
Dilución de soluciones y solución stock
Para diluir una solución es preciso agregar más % de disolvente a dicha solución y éste procedimiento nos da por resultado la dilución de la solución, y por lo tanto el volumen y concentración cambian, aunque el soluto no.
Una solución stock es la cual a partir de ella se puede hacer una disolución:
Solución Stock Nueva Solución
Solubilidad:
La solubilidad de un soluto en un disolvente es la concentración que presenta una disolución saturada, o sea, que está en equilibrio con el soluto sin disolver porque siempre habrá algunas moléculas o iones que pasen a la disolución. las sustancias se clasifican en:
Solubles: si su solubilidad es 0,1 M o >.
Poco Solubles: si su solubilidad se sitúa entre 0,1 M y 0,001 M
Insolubles: si su solubilidad no llega a 0,001 M
Factores que afectan a la solubilidad:
La temperatura: la mayoría de las disoluciones de sustancias sólidas son procesos endotérmicos y con un aumento de entalpía. Al disolver una sustancia sólida se produce la ruptura de enlaces (energía reticular)que casi nunca se compensa por la energía de solvatación. Por otra parte la destrucción de la estructura ordenada del sólido y la nueva disposición de las moléculas de disolvente alrededor del soluto conllevan un aumento de entropía. Como, unos valores negativos de H y de S positivos favorecen la espontaneidad del sistema por tanto la solubilidad de la mayoría de sustancias aumenta con la temperatura.
2. 1. 6. Preparación de los medios de cultivo
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos.
Composición y preparación de medios de cultivo
Formulaciones de diferentes medios
Medios comerciales
Composición:
_Minerales: macro y micronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I)
_Orgánica: azúcar, vitaminas, productos orgánicos y reguladores de crecimiento antioxidantes
2. 2. Esterilización:
Es la destrucción o eliminación completa de toda forma de vida microbiana. Puede llevarse a cabo por procesos físicos o químicos (vapor a presión, calor seco, óxido de etileno, líquidos químicos.
Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.
Procedimiento para la eliminación de microorganismos.
_ Autoclave: aparato en el que el medio, material de vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor bajo presión (121oC, 15 psi, 10-20 min.).
_Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.
_ Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire.
Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie del explanto: generalmente usando lavandina comercial diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.
_Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire
ESTERILIZACION
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Cristalería e instrumentos: Temperatura (ºC)- Tiempo (min.)
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121 15- 30
|
140 10-20
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160 7-15
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160-180 5-10
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Medios de cultivo, agua y soluciones: Volumen - Tiempo (min.) 121ºC
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20-50 15
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75 20
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250-500 25
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1000 30
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1500 35
|
2000 40
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Métodos de esterilización
Un material es considerado estéril cuando la probabilidad de supervivencia de cualquier microorganismo en el mismo es inferior a una entre un millón.
Los más utilizados son:
_Químicos (gases de óxido de etileno, entre otros)
_Físicos (calor húmedo o autoclave, calor seco o estufa)
_Irradiación (rayos gamma o ultravioletas)
_A bajas temperaturas (Formaldehído, Ácido Peracético, Peróxido de hidrógeno, etc.)
_Por filtración (filtros EPA)
Métodos químicos
_Oxido de Etileno
Métodos:
Químicos: Con oxido de etileno
AldehídosGas-plasma de Peroxido de Hidrogeno
Físicos: Calor Radiaciones
Filtración
Agentes esterilizantes y desinfectantes
Químicos: Con oxido de etileno
AldehídosGas-plasma de Peroxido de Hidrogeno
Físicos: Calor Radiaciones
Filtración
Agentes esterilizantes y desinfectantes
La destrucción de los microorganismos por esterilización por calor es una de la forma más común y preferido. There are two types of heat sterilization, the moist heat and dry heat sterilization. Hay dos tipos de esterilización por calor, el calor húmedo y la esterilización por calor seco. Radiation includes high-energy particles in order to sterilize microorganisms. La radiación incluye partículas de alta energía con el fin de esterilizar a los microorganismos. Chemical substances are used to sterilize air, solutions, or the surfaces of solids. Las sustancias químicas se utilizan para esterilizar el aire, soluciones, o las superficies de los sólidos
2. 2.1. Tipos de esterilización:
Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta, los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfección que evita la contaminación operatoria.
Generalidades:
_Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro para la salud de la población. Sólo es aplicable sobre objetos inanimados.
_Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como habitaciones.
_Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas (sólo pueden aplicarse externamente sobre seres vivos).
2.2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilización
FÍSICOS
_Fuego directo: mechero, colocando azas o pinzas. Funciona para cultivos de tejidos vegetales
_Agua hervida:
_Bacto-incinerador
_Luz ultravioleta: destruye cadenas de ADN de los microorganismos, antes de trabajar. 380- 220 nm
_Muflas- (estufas): calor seco de 190°C a 2hras. Se esteriliza, se colocan instrumentos como cajas de petri, pinzas, etc. (se toma en cuenta el tiempo y la temperatura)
_Filtración: se colocan una serie de filtros con poros pequeños que filtran bacterias o microorganismos, esto para compuestos termolábiles (A.I.A o AA)
_Calor húmedo: se utilza una olla de presión, se toma en cuenta: la presión 1.2 Kg/cm2 -- 15(PSI), tiempo 20 min., temperatura 121° C.
QUÍMICOS
_NaClO (hipoclorito de sodio): utilizado a 20min. Durante 1hra al 20%, sustancia a utilizar
_CaClO (hipoclorito de calcio)
_Oxido de etileno
Ozono
_HgCl2(bicloruro de mercurio): es la mejor sustancia a utilizar
_H2O2(peroxido)
_Nitrato de plata
_Yodex: sustancia a utilizar
_Aldehido
_Fenol
_Alcohol (etanol): sustancia a utilizar
2.3. Establecimiento el cultivo de tejidos:
El cultivo de tejidos in vitro comprende, en su acepción amplia, un heterogéneo grupo de técnicas mediante las cuales un explante (parte separada de un vegetal) se cultiva asépticamente en un medio de composición químicamente definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
Se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas.
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes.
El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación:
_Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
_Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee.
_Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
_Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir alos brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro
_Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
2.3.1 Etapas del cultivo de tejidos
_Etapa 0. Establecimiento de plantas donadoras de explante: es aquella donde se siembra la planta y de esa misma planta se extrae el explante que se va a cultivar
_Etapa 1. Instalación aséptica: es cuando la planta se coloca en condiciones con mucha asepsia en un medio de cultivo.
_Etapa2. Multiplicación: es cuando se lleva a cabo el sub-cultivo (la multiplicación in vitro), es decir la micropropagación.
_Etapa 3. Enraizamiento: es donde se lleva a cabo el enraizamiento de la planta, esta se saca del medio de cultivo y se coloca en una maceta.
_ETAPA 4. Adaptación a campo: esta etapa es la etapa final, en ella se lleva a cabo el trasplante de la planta directamente a campo.
2.3.2. Selección de plantas madres:
La selección de plantas madres orientada a la producción de clones de calidad es una búsqueda que requiere algo de dinero, tiempo y paciencia, pero que se ve recompensada con una producción continua de clones 100% hembra de primera calidad y de buena hierba.
El sistema es sencillo aunque dependiendo de la variedad elegida, índica o sativa, del número de semillas que pensemos germinar y el precio de estas, nuestra inversión puede dispararse un poco. Por este motivo, cuando muchos cultivadores hacen los cálculos correspondientes tanto del gasto (se necesitan dos cuartos de cultivo, uno para crecimiento y otro para la floración, semillas, luz, tierra, abonos, material para hacer esquejes...) como del tiempo que les puede llevar hacer una selección (entre cuatro y cinco meses de media sí el proceso parte desde semilla), muchos optan por comprar un lote de buenos esquejes para seleccionar los mejores y hacerse así una madre decente, pues como hemos dicho antes, también se pueden obtener plantas madre a partir de esquejes de calidad (aunque estos sean esquejes de otros esquejes).
Una buena solución para evitar que os "roben" una genética seleccionada es pasar o regalar siempre los esquejes o clones cuando estos ya han empezando a florar (aunque tengamos que forzar un poco el fotoperiodo) y muestren algún pistilo. De este modo será necesario el reflorarlos para inducirlos de nuevo al crecimiento y perderán gran parte de su vigor y su productividad quedando a salvo nuestra valiosa genética.
La Selección
La primera elección que debemos hacer es la de la variedad de planta que queremos cultivar y los rasgos concretos que buscamos en ella, como el vigor, la rapidez en el crecimiento, la producción de cogollos, la resistencia a enfermedades (sobre todo a hongos y mohos, la fuerza y el vigor de las ramas de nuestras plantas o la facilidad para enraizar que tienen estas ramas.
La selección básicamente consiste en germinar de uno a dos paquetes de semillas, como media, de la variedad de nuestra elección, hacer un par de esquejes de cada fenotipo, cultivarlos y fumarlos para elegir de entre todas esas plantas-
En principio, cualquier planta hembra, ya sea cultivada desde semilla o sea el esqueje de otro esqueje, e independientemente de su edad y estadio de desarrollo, puede convertirse en una planta madre.
Aunque es importante recalcar que los mejores resultados se obtienen de plantas hembras sanas y seleccionadas por sus especiales características, con al menos dos meses de edad, y que no hayan sido refloradas.
También se puede dar una degeneración si las plantas madre están infectadas por algún virus o por alguna enfermedad u hongo. No uséis nunca plantas enfermas, revegetadas o con estrés, ni ejemplares vulgares como plantas madre. Seleccionar solo aquellas plantas o esquejes sanos que muestren alguno de los rasgos antes mencionados.
2.3.3. Explante
Tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento.
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan.
Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo.
Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de unas semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.
2.3.5 Condiciones de incubación:
Las condiciones de incubación engloba una serie de conceptos que por su mayoría son generales y se abarcan en todo sitio de laboratorio en medio de cultivo in vitro. Enseguida se hablara de unos conceptos generalizados de estas condiciones de incubación.
Para que una planta cresca naturalmente necesita de 5,000 a 8,000 Lux (Lux, es una cierta medida de luz natural); para un cultivo de tejido vegetal se necesita 2,000 a 2,500 Lux.
Se establece una temperatura de 18-25°C.
Debe de conservarse la polaridad de la planta madre; puede llegar a suceder una polaridad invertida (>x<) esto va depender de los ápices, raíces, hojas, semillas, tallos y yemas.
La fase gaseosa es nula o es muy poca. La concentración de CO2 al medio ambiente es de 0.03%.
Se habla de humedad relativa en este caso dentro del frasco, pues se pueden encontrar pequeñas gotas adheridas en la pared del mismo, esto es el 100% de la humedad que se contiene en el frasco. Es diferente la humedad en in vitro al ambiente natural.
Para realizar un trasplante de cultivo a sustrato se llevan acabo cambios fisiológicos tanto en la adaptación al medio ambiente, pues implica la humedad relativa en este caso es de 70%, esto lleva a la evaporación y transpiración de agua en la planta, función que realizan tanto en la epidermis, parénquima y estomas para la regulación del agua tanto entrada como salida; cuando se presenta calor y aire o viento seco es menos viable la adaptación de la planta al sustrato y principalmente al medio. La fotosíntesis, uno de los procesos mas importantes en la planta, tiene que estar estrictamente presente para la adaptación ya sea permanente o temporal de la plántula, pues implica funciones fisiológicas tanto en las raíces, hojas, tallos, yemas y demás partes de esta.
2.3.7. Trasplante al sustrato:
Sustratos de cultivo
Un sustrato es todo material sólido distinto del suelo, natural, de síntesis o residual, mineral u orgánico, que, colocado en un contenedor, en forma pura o en mezcla, permite el anclaje del sistema radicular de la planta, desempeñando, por tanto, un papel de soporte para la planta. El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutrición mineral de la planta
También el sustrato la base de plántulas sanas. Un sustrato creciente de que es
limpio, libre de enfermedad y cuenta con espacios para el aire y el agua permitirá que la planta de semillero una oportunidad de crecer a su mejor potencial.
Tipo correcto de sustrato
Estructura con contenedores específicos. Una bandeja plana o de semillas requiere un sustrato más pesado; Considerando que, una bandeja con pequeñas células en crecimiento requiere un sustrato ligero. El sustrato debe estar bien equilibrado y contienen ingredientes que proveen materiales absorbentes para la celebración de agua y adecuada porosidad para espacios de aire de modo que las raíces tendrá oxígeno adecuado.
Las semillas necesitan la derecha, la cantidad de oxígeno y el agua antes de comenzar la germinación proceso. Las semillas empiezan mediante la absorción de agua, a continuación, enviar el radical que es el precursor de la raíz en el sustrato de crecimiento.
Los cotiledones abrir tan pronto como el radical entra en el creciente sustrato, proporcionando una fuente de nutrientes para el radical hasta que el radical tiene desarrollado en una raíz que es capaz de absorber agua y nutrientes.
http://www.biologia.edu.ar/microind/esterilizaci%C3%B3n.htm
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_de_tejidos_vegetales#Etapas_del_proceso
http://books.google.com.mx/books?id=EXijYNw55DUC&pg=PA36&lpg=PA36&dq=2.3.+Establecimiento+Del+Cultivo+De+Tejidos&source
http://www.cannabismagazine.es/digital/articulos/22/916-plantas-madre-seleccion-y-cuidados
https://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:ppZzzKCT3Y0J:www.inia.org.uy/publicaciones/documentos/lb/ad/2004/ad_382.pdf+Cambios+fisiol%C3%B3gicos+del+explante&hl=es&gl=mx&pid=bl&srcid=ADGEEShm1cgR55Ejjn.
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